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顾宁、张宇课题组「纳米酶」方向研究进展

日期: 2020-07-06
浏览次数: 14

新型「仿生」纳米药物递送系统:如何实现细胞外囊泡载药?

纳米酶作为具有模拟酶性质的功能必威官网,既能克服天然酶稳定性差、制备成本高等缺点,又具有必威官网的可设计性、多功能性、可操纵性及可应用性[1]东南大学顾宁、张宇课题组在纳米酶领域取得了相关研究进展,例如氧化铁、氧化钴、普鲁士蓝、金纳米酶的催化机制研究、纳米酶的体外检测、成像、细胞保护及肿瘤治疗、纳米酶相关国家标准等


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01?氧化铁纳米颗粒pH依赖的类双酶活性
该研究利用电子自旋共振技术(ESR)首次发现氧化铁纳米颗粒(IONPs)具有pH依赖的类双酶活性:在酸性条件下,IONPs能够与H2O2反应,生成具有高毒性的羟自由基(·OH),表现出类过氧化物酶(POD)活性;在中性条件下,能够催化H2O2的歧化反应,分解为无毒的H2O和O2,表现类过氧化氢酶(CAT)活性[2]
该研究证明IONPs在细胞中的分布及细胞内微环境是影响其细胞毒性的重要因素,即:当IONPs定位于细胞溶酶体中,将产生较强的毒性作用;定位于细胞质中则具有较好的解毒作用(图1)。因此,溶酶体逃逸策略是一种有望降低IONPs给药中长期毒性的有效方法。

顾宁、张宇课题组「纳米酶」方向研究进展


1:氧化铁纳米颗粒pH依赖的类PODCAT活性



02?四氧化三钴纳米颗粒类多酶活性及电荷转移催化机制

本研究证明了四氧化三钴纳米颗粒(Co3O4?NPs)具有类CAT、POD和SOD 酶活性[4]。利用电子自选共振技术研究其催化机制,表明Co3O4?NPs的类POD活性不遵循类芬顿反应产生·OH,而是Co3+/Co2+较高的氧化还原电位使Co3O4?NPs具有较强的氧化性,可作为电子传递介质将TMB的电子直接转移给H2O2(图2)。在中性条件下,H2O2倾向于缓慢分解,Co3O4?NPs有助于加速这一过程,因为H2O/O2的氧化还原电位很低,H2O2很容易被Co3+氧化。基于Co3O4?NPs较强的类POD酶活性,编辑设计了一种新的免疫组化方法,将Avastin抗体偶联到Co3O4?NPs表面,获得的偶联物用于检测肿瘤组织中过表达的血管内皮生长因子(VEGF)。?



顾宁、张宇课题组「纳米酶」方向研究进展

图2:Co3O4?NPs 类POD酶活性催化机制


03?普鲁士蓝纳米颗粒类多酶活性及活性氧清除功能

活性氧(ROS)的产生是必威官网毒性的重要机制之一。研究发现普鲁士蓝纳米粒颗粒(PBNPs)具有类POD、CAT、超氧化物歧化酶(SOD)等多酶活性,并能够有效清除ROS[3]。机制研究表明,与氧化铁纳米颗粒类芬顿反应产生·OH不同,PBNPs能够抑制·OH的生成。编辑首次推测,PBNPs的类多酶样活性可能是由于PBNPs丰富的氧化还原电位使其成为高效的电子转运体(图3)。

为了研究PBNPs清除ROS的能力,建立了一系列的体外ROS生成模型,包括化学药物刺激、脂多糖诱导炎症、紫外线照射、神经细胞缺氧复氧等,PBNPs加入均能清除产生的ROS,有效抗氧化并提高细胞活性,并且具有剂量依赖性。同时采用脂多糖诱导建立了小鼠炎症模型,同样表明了普鲁士蓝纳米颗粒能够抑制炎症反应。


顾宁、张宇课题组「纳米酶」方向研究进展

图3:PBNPs 类多酶活性及其催化机制


04?分子印迹提高金纳米颗粒类葡萄糖氧化酶的选择性

纳米酶缺乏对催化底物的选择性一直以来是制约必威官网在实际应用中代替天然酶的重要因素之一,同样也是国内外科研人员致力于解决的重要问题。为此,采用氨基苯硼酸在碱性条件下结合葡萄糖分子的邻位羟基,将葡萄糖分子印记在金纳米颗粒(AuNPs)表面,经洗脱后,在AuNPs表面留下葡萄糖分子口袋。

随后氨基苯硼酸聚合形成分子印迹壳层这种策略实现了AuNPs作为类氧化酶对底物葡萄糖的选择性(图4)。此外,加入具有供氧能力的全氟溴辛烷能够进一步加强AuNPs的催化活性。与单纯的AuNPs相比,本工作制备的具有葡萄糖分子印迹壳层的载氧AuNPs的催化效率提升了270倍,并成功用于实际样品(饮料、血液)中葡萄糖含量的检测[5]


顾宁、张宇课题组「纳米酶」方向研究进展

图4:具有葡萄糖分子印迹壳层的载氧AuNPs的制备示意图


05?普鲁士蓝纳米酶用于超声-磁共振双模态成像

ROS诱导的过量H2O2的产生可以作为一种潜在的诊断标记物,用于判断多种病理状态的存在和进展。根据PBNPs在中性条件的类CAT酶活性能够催化H2O2分解为O2的特性,开发了基于PBNPs的高灵敏度、高分辨率的超声和磁共振双模成像探针,用于体内/外诊断H2O2?(图5)[6]
氧气泡的生成改变了氧化应激组织的声阻抗,使PBNPs作为超声造影剂来增强超声成像效果。同时,纳米颗粒表面Fe3+中心易于与H2O进行交换及具有顺磁性的氧气泡能够缩短T1弛豫时间,使PBNPs还能作为T1磁共振造影剂。



顾宁、张宇课题组「纳米酶」方向研究进展

图5:PBNPs 用于超声-磁共振双模态成像示意图



06?可注射超分子磁性水凝胶:磁热纳米酶携手治疗肿瘤
为了克服温和磁感应热疗中肿瘤细胞对热应激的耐受性问题,本工作创新性地将Fe3O4纳米酶催化治疗引入到磁感应热疗中,为肿瘤协同治疗提供了新的策略(图6)。
该工作以PEG和α-环糊精通过包合作用构建具有剪切变稀效应和温敏相转变能力的超分子水凝胶作为治疗平台,以PEI修饰的8 nm?Fe3O4纳米颗粒为磁热源和类过氧化物酶[7]。将凝胶注射于肿瘤组织,施加交变磁场使Fe3O4颗粒产热至42 °C,肿瘤组织得到热疗的同时凝胶液化促进凝胶中各组分在肿瘤细胞间隙扩散,并利用凝胶中复合的载葡萄糖纳米胶囊与葡萄糖氧化酶反应产生较高浓度的H2O2。Fe3O4颗粒在肿瘤微酸性环境中发挥模拟酶功效,通过芬顿反应催化H2O2产生·OH杀伤肿瘤细胞。此外,热疗产生的热量能够增强Fe3O4类POD酶活性,产生更多?·OH。·OH 进一步损伤热疗中高表达的热休克蛋白HSP 70等,使得热疗效果提升。
这一基于磁性纳米颗粒磁感应热疗和纳米酶促氧化的协同治疗使得肿瘤治疗效果显著,42°C 温热疗即可消退小鼠乳腺癌皮下肿瘤。


可注射超分子磁性水凝胶:磁热纳米酶携手治疗肿瘤

图6:可注射超分子水凝胶磁感应热疗协同纳米酶治疗小鼠肿瘤示意图


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07?建立纳米酶国家标准:《纳米技术氧化铁纳米颗粒类过氧化物酶活性测量方法》
在国家重大科学研究计划以及国家重点研发计划的持续支撑下,历时近五年的研究、论证和评审,东南大学联合中科院生物物理所、中国医科院基础医学研究所以及betway88必威等单位研制并起草的国家标准《纳米技术氧化铁纳米颗粒类过氧化物酶活性测量方法》(GB/T37966-2019)通过全国纳米技术标准化技术委员会组织的终审,并获得国家市场监督管理总局、中国国家标准化管理委员会批准发布实施[8]
该标准规定了氧化铁纳米颗粒类过氧化物酶活性的测量方法适用于采用分光光度计对氧化铁纳米颗粒类过氧化物酶活性进行测量和评价该标准可作为其他种类纳米颗粒类过氧化物酶活性测量的参考,对规范生物医学应用中纳米颗粒类酶活性的科学计量方法,突破生物医学应用转化的瓶颈具有极为重要的价值。
测量原理本标准采用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)作为测量底物,在37℃和酸性条件(pH= 3.6)下经氧化铁纳米颗粒的催化,TMB被H2O2氧化为蓝色的TMB衍生物,该衍生物在650nm波长下有特征吸取峰。在37℃、650nm波长下检测反应溶液吸光度随时间的变化,并根据朗伯比尔定律计算出单位时间内TMB衍生物的生成量,从而得到氧化铁纳米颗粒所含酶活性单位数(bnano)。将bnano除以加入的氧化铁纳米颗粒的铁元素质量,得到氧化铁纳米颗粒类过氧化物酶活性(anano)。


顾宁、张宇课题组「纳米酶」方向研究进展

图7:氧化铁纳米颗粒类过氧化物酶活性测量原理图


尽管当前该领域已有大量有关开发新型纳米酶或通过巧妙设计提高纳米酶活性的相关工作,但想要成为优秀的天然酶替代物,纳米酶仍然面临着众多挑战。目前还存在一些亟待解决的问题,如:对于纳米酶催化本质的理解、必威官网表面化学性质与催化活性之间的复杂关系、扩大纳米酶的催化类型、提高催化底物的选择性、相关标准的制定、纳米酶与体内复杂生物系统的相互作用等。
先进的表征技术手段和各领域科学家们的通力合作是十分必要的。只有对这些问题有了深入透彻的理解和解决,纳米“新星”—纳米酶才有望在未来以更加明确和独特的优势,真正地代替天然酶应用于医学、食品、化工、农业、环境等领域,为国家工业发展及人们生活质量提高做出更大的贡献。
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参考文献:

[1] Dong H, Fan Y, Zhang W, et al. CatalyticMechanisms of Nanozymes and Their Applications in Biomedicine[J]. BioconjugateChemistry, 201930(5): 1259-1584.

[2] Chen Z, Yin J J, Zhou Y T, et al. DualEnzyme-like Activities of Iron Oxide Nanoparticles and Their Implication forDiminishing Cytotoxicity[J]. ACS Nano, 2012, 6(5): 4001-4012.

[3] Zhang W, Hu S, Yin J J, et al. Prussian BlueNanoparticles as Multienzyme Mimetics and Reactive Oxygen SpeciesScavengers[J]. Journal of the American Chemical Society, 2016, 138(18): 5860-5865.

[4] Dong J, Song L, Yin J J, et al. Co3O4Nanoparticles with Multi-Enzyme Activities and Their Application inImmunohistochemical Assay[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2014,6(3): 2014, 6: 1959-1970.

[5] Fan L, Wu H, Lou D, et al.?A NovelAuNPs-based Glucose Oxidase Mimic with Enhanced Activity and SelectivityConstructed by Molecular Imprinting and O2-Containing NanoemulsionEmbedding[J]. Adv. Mater. Interfaces, 2018, 5, 1801070.

[6] Yang F, Hu S, Zhang Y, et al. A HydrogenPeroxide-Responsive O2?Nanogenerator for Ultrasound andMagnetic-Resonance Dual Modality Imaging[J]. Advanced Materials, 2012, 24(38): 5205-5211.

[7] Wu H, Liu L, Song L, et al. Enhanced TumorSynergistic Therapy by Injectable Magnetic Hydrogel Mediated Generation ofHyperthermia and Highly Toxic Reactive Oxygen Species[J]. ACS Nano, 2019,13(12):14013-14023.

[8]国家标准:《纳米技术氧化铁纳米颗粒类过氧化物酶活性测量方法》GB/T 37966-2019.



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